برای تعیین اثر قارچ کشی یا قارچ ایستایی مواد ترشح شده، قرص اینوکولوم ورتیسلیوم از پتریهایی که در آنها پس از ۹۵ ساعت هیچگونه رشدی نکرده، به پتریهای دیگر حاوی محیط کشت PDA تازه، منتقل و مدت یک هفته در انکوباتور با دمای ۲± ۲۵ درجه سانتی گراد نگهداری شده، تا نحوه و میزان رشد مجدد آنها بررسی شود (Thomson, 1989).
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۳-۹-تهیه مایه تلقیح عامل بیماری و آنتاگونیستها
برای تکثیر تریکودرما از سبوس تخمیر شده استفاده شد. جهت جلوگیری از سفت و متراکم شدن محیط از مخلوط سبوس گندم و سبوس اولیه برنج به نسبت وزنی مساوی استفاده گردید. سبوسها ابتدا داخل کیسه پارچهای ریخته شده و بعد از خیساندن در آب مقطر، با فشار دادن کیسه آب اضافی خارج شد. سپس سبوسها به داخل کیسههای نایلونی منتقل و به مدت یک ساعت در حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد دراتو کلاو سترون و بهمدت ۱۰ روز درشرایط گلخانه، در دمای ۲۶ تا ۳۰ درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی ۸۰% به طور روباز قرار گرفته تا کاملاً تخمیر گردند. بعد سبوسهای تخمیر شده در وزنهای ۵۰۰ گرمی تقسیم و در داخل ارلن مایرهای یک لیتری دو بار و بفاصله ۲۴ ساعت اتوکلاو شدند. در این روش جهت مایه زنی به ازای هر ۱۰۰ گرم سبوس، ۵ میلی لیتر آب مقطر حاوی ۱۰۸ اسپور اضافه شد. ارلنها پس از مایه زنی در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری شدند (Elad et al., 1986).
۳-۱۰- اثر جدایههای تریکودرما در کنترل بیماری در شرایط گلخانه
برای این منظور بذر پنبه پس از دلینته شدن، به مدت ۲۴ ساعت در آب مقطر خیسانده شده و پس از ۳۰ دقیقه ضدعفونی در محلول هیپوکلریت سدیم ۵/۰%، سه بار با آب مقطر استریل، شستشو و جهت جوانه زنی در روی کاغذ صافی استریل قرار گرفت.
مایه تلقیح قارچ عامل بیماری و آنتاگونیست با تهیه سوسپانسیون اسپور به غلظت۱۰۸ ×۱ اسپور در هر میلی لیتر از کشت چند روزه و کاملا رشد یافته جدایههای برتر روی محیط کشت PDA انجام گرفت.
بذرهای پنبه جوانه زده به روش بالا، ابتدا به مدت ۲۴ ساعت در سوسپانسیونی به غلظت۱۰۸ ×۱ اسپور در هر میلی لیتر از قارچ عامل بیماری خیسانده و سپس در زیر هود استریل به مدت ۱۵ دقیقه قرار گرفته تا خشک شوند. بعد از خشک شدن، بذورآلوده به قارچ عامل بیماری درارلن حاوی سوسپانسیون اسپور جدایه های مختلف قارچ تریکودرما به غلظت۱۰۸ ×۱ اسپور در هر میلی لیتر به مدت سه ساعت قرار گرفتند (برگس و هپ ورس ۱۹۹۶).
بذور تیمار شده در گلدانهای پلاستیکی متوسط حاوی خاک استریل (دو بار به فاصله ۲۴ ساعت اتوکلاو شده) کشت و در گلخانه نگهداری شدند. در این آزمون ۲ تیمار شاهد شامل یک تیمار شاهد سالم (بذر بدون مایه زنی با قارچ عامل بیماری و تریکودرما) و یک تیمار شاهد آلوده ( بذر مایه زنی شده با قارچ عامل بیماری) در نظر گرفته خواهد شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با ۳ تکرار انجام گرفت. ارزیابی آزمایش با تعیین درصد، شاخص بیماری پس از پیشرفت آلودگی در تیمار انجام گرفت. جهت محاسبه درصد وقوع بیماری و شاخص بیماری[۲۱] از فرمولهای زیر بر اساس روش کاردوس و همکاران (۲۰۰۴) استفاده گردید:
:X تعداد بوته های بیمار و :N تعداد کل بوته های ارزیابی شده
:Xi درجه بیماری و :ni تعداد گیاهان بیمار در درجه i ام بیماری، N تعداد کل گیاهان مورد ارزیابی و V بالاترین نمره بیماری است.
درجه بیماری ﺑــﺮ اﺳــﺎسﻣﻘﻴــﺎس ۰ ﺗﺎ۴ (۰= ﺑﻮﺗــﻪﻛﺎﻣﻼً ﺳــﺎﻟﻢ، ۴= ﺑﻮﺗــﻪﻛــﺎﻣﻼﻟﺨﺖ و ﺑﺪونﺑﺮگ و ﻗـﻮزه) و ﻣﻌﻴـﺎر ﺑﻴﻤـﺎری ﺑـــﺎ اﺳـــﺘﻔﺎده از فرمول زیر تعیین گردید (بجارنو- آلکازار و همکاران ۱۹۹۵). و در نهایت درصد کنترل بیماری برای هر تیماردر مقایسه با شاهد محاسبه و داده ها مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفته و میانگینها با آزمون دانکن مقایسه شدند.
فصل چهارم
نتایج
۴–۱– مزرعه
۴-۱-۱- جمع آوری نمونه
در این بررسی تعداد ۵ نمونه خاک از مزارع پنبه شهرستان گنبد استان گلستان جمع آوری گردید.
۴-۲- آزمایشگاه
۴-۲-۱-شناسائی جدایه های تریکودرما
از مجموع ۱۴ جدایه تریکودرما که از کشت خاک مزارع پنبه گنبد بدست آمده، ۳ جدایه دارای خاصیت آنتاگونیستی بوده اند و به عنوان جدایه های برتر انتخاب شدند که شامل جدایه های: ۳ گونه Trichoderma harzianum، T.virens و T. asperallum قرار گرفتند و بر اساس کلید معتبر کوبیسک و هارمن (Kubicek and Harman, 1998) جدایه های تریکودرما شناسایی شدند که توصیف آنها به شرح زیر است:
۴-۲-۱-۱- مشخصات قارچ Trichoderma harzianum
کلنی این قارچ سریع الرشد بوده و بعد از ۴ روز قطر آن روی محیط مالت آگار ۲% در دمای ۲۱ در جه سانتیگراد به ۹-۷ سانتی متر رسید.
ریسه های هوایی قارچ کرکی، سفید تا متمایل به خاکستری و ندرتا متمایل به زرد می باشند.کنیدیزایی گاهی اوقات به صورت دوایر متحدالمرکز یا متراکم نزدیک حاشیه پتری دیش غالبا به صورت توده های بزرگ نامنظم و به هم پیوسته تشکیل می شد. پشت کلنی بی رنگ تا زرد کم رنگ بوده است. کلنی بوی نا معلوم یا کمی بوی خاک می داد.
کنیدیوفورها شدیدا منشعب و شاخه های اولیه با زاویه راست منشعب شده یا به طرف نوک متمایل می شوند. فیالیدها آمپولی شکل تا تنگی شکل و اندازه آن ها ۱۲/۳-۵۶/۱×۲۴/۶ میکرومتر و طول فیالید انتهایی حدود ۱۰ میکرومتر بوده است. فیالید ها به طور قابل توجهی در قسمت پایه جمع شده ودر قسمت میانی متورم و به طور ناگهانی در محل تولید کنیدیوم باریک می شوند. آن ها معمولاً در دسته های ۴- ۳ تایی و گاهی به صورت جفتی بودند.
قارچ T. harzianum به سادگی به وسیله کنیدی های کوچک به ابعاد ۱/۳- ۳/۲ × ۹/۳-۳۴/۲ میکرومتر، تقریبا ً کروی تا بیضی و با داشتن کنیدیوفورهای کم تراکم از نوع کنیدیوفور بخش Trichoderma، از سایر گونه ها قابل تفکیک می باشد. مهمترین فاکتورهای موثر در رشد این قارچ درجه حرارت و pH می باشد. بیشترین جدایه های قارچ T. harzianum مزوفیل[۲۲] بوده و در دامنه دمایی بین ۲۵-۳۰ درجه سانتی گراد و نور کافی محیط بهترین رشد را دارند (شکل ۳-۱).
A
شکل ۳-۱: کلنی قارچ T. harzianum روی محیط کشت PDA (A)، و کنیدی ها (B) و کنیدیوفور و فیالید ها © اقتباس از پایان نامه رودگر(۱۳۸۹)
Fig. 3-1. Colony of T. harzianum on PDA (A) and Conidia(B), Conidiophore and Phialids©. Adaptation of rodgar thesis (2010)
۴-۲-۱-۲- مشخصات قارچ Trichoderma virens
کلنی این قارچ نیز بهسرعت رشد کرده، ریسه های هوایی قارچ کرکی، سفید تا متمایل به خاکستری بودند. کنیدی زایی اکثرا به طور برجسته پراکنده و تمام سطح پتری دیش را پوشانده و یا تشکیل جوشهای صاف و پراکنده فراوان را دادهاند. رنگ کلنی ابتدا سفید، ولی به سرعت به رنگ سبز متمایل به آبی تغییر کرده و نهایتاً سبز تیره شد. پشت کلنی معمولاً بیرنگ یا زرد کم رنگ بود. فیالیدها تنگی تا آمپولی شکل و به صورت همگرا و اکثرادر دستجات ۵- ۲ تایی، روی انشعابهای انتهایی قرار میگرفتند. کنیدیها عموما بیضی تا تخم مرغی، به اندازه ۹/۳- ۳۴/۶× ۲۴/۶- ۱۲/۳ میکرومتر و به رنگ سبز تیره بودند. کنیدیها روی فیالیدهای جانبی اغلب به هم پیوسته و به صورت مجتمع و تشکیل توده کروی بزرگی داده و در زیر میکروسکوپ به صورت یک دسته دیده میشدند (شکل۴-۸).
C
B
A
شکل ۴-۸–کلنی قارچ T.virens روی محیط کشت PDA(A) کنیدیوفور فیالیدها (B) کنیدی ها © اقتباس از پایان نامه رودگر(۱۳۸۹)