-
-
- ژنوم موجودات عالی بسیار بزرگ و پیچیده است برای مثال ژنوم انسان ۱۰۹×۳ جفت باز دارد و در نتیجهی هضم آن با آنزیمی مانند EcoRI بیش از یک میلیون قطعهی DNA به وجود میآید. تفکیک این تعداد مولکولDNA حتی با الکتروفورز دو بعدی نیز غیر ممکن است.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
-
-
- معمولا DNA ژنومی در هنگام استخراج به صورت تصادفی و غیراختصاصی شکسته میشود و ایجاد مولکولهایی با انتهای تصادفی میکند. این امر سبب ایجاد پسزمینهی ناشی از نشاندار شدن این انتهاها طی فرایند نشاندارکردن میشود(۹).
برای رفع این دو نقص تدابیری پیشبینی شد و روش RLGS ابداع گردید. این روش جدید که برای تجزیه و تحلیلDNA ژنومی بهکار میرود، بر مبنای این فرضیه است که نقاط برش اختصاصی آنزیمهای محدودگر میتوانند بهعنوان نشانه و وجهه تمایز ارقام و افراد به کار گرفتهشوند.
در این روش انتهای آزاد مولکولهای DNA که در اثر صدمات مکانیکی در طی استخراج به وجود آمدهاند، مسدود میشود. سپس برای کاهش پیچیدگی، DNA ژنومی توسط آنزیمهای محدودگر، با محل برش نادر، هضم و نقاط برش بهطور مستقیم با فسفر پرتوزا نشاندار میشوند. آنزیمهای با محل برش نادر معمولا هزاران قطعه DNA به وجود میآورند. سپس با الکتروفورز دوبعدی، قطعههای هضمشدهیDNA از هم جدا شده و خودپرتونگاری صورت میگیرد. این روش یک الگوی دو بعدی با هزاران نقطهی پراکنده (قطعههای نشاندارDNA) ایجاد میکند که هر یک میتوانند به عنوان یک نشانگر به کار گرفته شوند(۱۰)
برخی از مزایای روشRLGS
-
- در هر آزمایش هزاران نشانگر بهدست میآید؛
-
- مقدار کمی DNAمورد نیاز است؛
-
- در صورت استفاده از آنزیمهای محدودگر متفاوت، تفاوتهای بیشتری ظاهر و ثبت خواهند شد[۱۰].
برخی از معایب روش RLGS
-
- DNA مورد نیاز برای این روش باید از کیفیت مطلوبی برخوردار باشد؛
-
- هضم ناقص DNA توسط آنزیمهای محدودگر نتایج تکرار ناپذیر و گمراه کنندهای خواهد داشت؛
-
- این روش پیچیدگی فوق العادهای داشته و تفسیر نتایج حاصل از آن دشوار است(۱۰).
۱-۳-۳-۱-۳ ماهوارکها
ماهوارکها نخستین بار در سال ۱۹۸۵ توسط جفری[۲۰] و همکاران گزارش شدند. پس از آن در سال ۱۹۸۸ تکثیر جایگاههای ژنی خاص نواحی تکرارشونده، روی ماهوارکها در ژنوم انسان انجام شد.
این دسته از نشانگرها از نظر تکنیکی مبتنی بر استفاده از کاوشگرهای مصنوعی و کاربرد مواد پرتوزا و روش ساترن[۲۱] هستند.
ماهوارکها واحدهایی ۱۰ تا ۱۰۰ جفت بازی هستند که ممکن است صدها بار تکرار شده باشند. آنها معمولا یک هسته مشترک ۱۰ تا ۱۵ جفت بازی دارند که احتمالا در تنوعپذیری ماهوارکها موثرند. ماهوارکها بیشتر در نواحی یوکروماتین ژنوم پستانداران، قارچها و گیاهان متمرکزند. تنوعپذیری ماهوارکها در حدی است که گاهی در انگشتنگاریDNA انسان مورد استفاده قرار میگیرند. از جملهی ماهوارکها میتوان به تکرارهای پشت سر هم با فراوانی بالا[۲۲] (VNTR) اشاره کرد[۱۱]. VNTR ها به دو دستهی کلی تقسیم میشوند: VNTR تک مکانی[۲۳] و VNTR چند مکانی[۲۴].
دستهی نخست، تعداد متفاوت ردیفهای تکراری در یک جایگاه ژنی و دستهی دوم تعداد متفاوت ردیفهای تکرارشونده در چندین جایگاه ژنی را نشان میدهند. الگوی بانددهی بهدست آمده با بهره گرفتن از کاوشگرهای VNTR تک مکانی سادهتر و قابل فهمتر است، زیرا هر فرد تعداد کمی باند واضح را نشان میدهد. در حالیکه تعداد باندهای به دست آمده از کاوشگرهای مخصوص VNTRچندمکانی بیشتر است، بهطوری که بهطور همزمان تا بیش از ۳۰ باند به دست میآید(۱۲).
در نخستین نشانگرهای مبتنی بر ماهوارکها، از الیگونوکلئوتیدهای حاوی ریزماهواره به عنوان کاوشگر استفاده گردید و توسط علی[۲۵] و همکاران انگشتنگاری الیگونوکلئوتیدی[۲۶] نامگذاری شد.
از کاوشگرهای الیگونوکلئوتیدی نشاندارشده مکمل با موتیفهای کوتاه تکرارشونده در هیبریداسیون[۲۷] در ژل، با به کارگیری DNAژنومی برش داده شده با آنزیمهای برشی خاص و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شده است. گوبتا و وارشنی[۲۸] در سال۲۰۰۰ طی تحقیقات خود مراحل زیر را برای انگشتنگاری الیگونوکلئوتیدی مطرح کردند:
-
- جداسازیDNA ژنومی با وزن مولکولی زیاد
-
- هضم DNAژنومی با یک آنزیم محدودگر مناسب
-
- تفکیک قطعههای حاصل از هضم روی ژل آگارز
-
- انتقال ساترن قطعه ها به غشا
-
- دو رگگیری غشا با کاوشگرهای(نشاندار با مواد پرتوزا یا غیر پرتوزا) الیگونوکلئوتیدی دربردارندهی ردیفهای دو یا سه تایی تکراری
-
- خودپرتونگاری یا رنگ آمیزی برای مشاهدهی قطعههای دو رگشده.
بهکمک این روش میتوان تنوع نواحی تکرارشوندهی مورد نظر را آشکار کرد. قطعههایی از DNA که با الیگونوکلئوتیدها دو رگ میشوند، در دامنهای از اندازهی چند صد جفت تا ده کیلو جفت باز قرار میگیرند. همچنین گاهی بیش از یک نوع ماهواره در داخل یک قطعهی برش داده شده قرار میگیرد. تفاوتهایی که این نوع نشانگرها نشان میدهند، به دلیل تفاوت در طول قطعههای برش دادهشدهای است که در بردارندهی ماهوارکها هستند. از این روش برای شناسایی ژنوتیپها و همچنین در ژنتیک جمعیت استفاده میشود(۱۲).
پس از مدتی، لیت و لوتی[۲۹] و سه گروه دیگر همین روش را برای ریزماهوارهها(عمدتا از نوع (CA)n) بهکار بردند و دریافتند که ریز ماهوارهها به دو دلیل به مراتب آسانتر از ماهوارکها با روش PCR تکثیر میشوند:
۱-ریزماهوارهها کوچکتر از ماهوارکها هستند؛
۲-ردیفهای تکرارشونده ریز ماهوارهای فراوانتر و توزیع آنها در کل ژنوم یکنواختتر ازماهوارکهاست(۱۳).
۱-۳-۳-۲ نشانگرهای مبتنی بر PCR
نشانگرهای مبتنی بر PCR نشانگرهایی هستند که از توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر برای تکثیر قطعهی خاصی از DNA استفاده میکنند. روشهای مختلف در این گروه، در طول و توالی آغازگرها، سختی شرایط PCR و روشهای جداسازی و آشکار کردن قطعات با همدیگر فرق دارند.
انواع نشانگرهای مبتنی بر PCR به شرح زیر است:
-
- تفاوت طول قطعههای حاصل از تکثیر[۳۰](AFLP)
-
- DNA چند شکل تکثیرشدهی تصادفی[۳۱](RAPD)
-
- تفاوت تک نوکلئوتیدی[۳۲](SNP)
-
- نشانگرهای مبتنی برنقاط نشانمند از ردیف[۳۳] (STS)
۱-۳-۳-۲-۱ تفاوت طول قطعههای حاصل از تکثیر (AFLP)